Подобно большинству дошедших до нас русских икон Троицы XVI века, основанных на ветхозаветном сюжете «Гостеприимство Авраама» (Быт. 18), икона из Борисоглебского монастыря соединяет в себе несколько иконографических традиций. Хотя в позах и жестах ангелов ощущается заметное влияние рублевской иконографии, круговое построение композиции здесь практически не выражено. Напротив, ее горизонтальная ориентация подчеркнута не только вытянутой формой стола, но и расположением ангельских фигур, близким к изокефалии. Выбор такого композиционного решения был, вероятно, обусловлен стремлением подчеркнуть не единство, а именно равенство трех ипостасей (как понятие более очевидное и наглядное), его непосредственным прототипом могли послужить какие-то византийские или поствизантийские иконы, поскольку изображения Троицы с отчетливо выраженной горизонтальной ориентацией получили распространение в византийском искусстве уже со второй половины XIV века. Подобное сочетание традиций в точности соответствует определению московского Стоглавого собора 1551 года, который на вопрос о том, как писать Святую Троицу, дал следующий ответ: «Писати живописцем иконы с древних образцов, как греческие живописцы писали и как писал Ондрей Рублев и прочии пресловущии живописцы…»

Изображения палат Авраама, мамврийского дуба и горы значительно крупнее и выше, чем у Рублёва, и более детально проработаны, что было, вероятно, связано с желанием сделать более наглядным их символическое значение. Наконец, здесь, как и во многих других русских иконах Троицы XVI века, вновь появляются изображения праотцев Авраама и Сарры: они представлены стоящими перед ангельской трапезой, с сосудами в вытянутых руках. Внизу, между ними, располагается изображение слуги, закалывающего тельца, – оно сильно уменьшено по сравнению с ангельскими фигурами и фигурами праотцев и помещено внутри подобия пещеры, очерченной условным контуром. Расположение сцены заклания тельца непосредственно под чашей, которую благословляет центральный ангел, дополнительно подчеркивает символическое сопоставление ветхозаветного жертвоприношения с Искупительной жертвой Христа. Значение чаши, как композиционного и смыслового центра изображения, усиливают протянутые руки Авраама и Сарры. Редкой особенностью иконы являются белые покровы, наброшенные на края стола, – возможно, они должны были ассоциироваться с покровами алтарного престола.

Иконы, поступившие в Третьяковскую галерею из Борисоглебского монастыря через Ярославский музей, не имели сведений о происхождении и могли находиться как в самом монастыре, так и в храмах окрестных сел. Поскольку в Борисоглебском монастыре не было ни одного престола, посвященного Святой Троице, существование здесь большой местной иконы на этот сюжет маловероятно. Не упоминаются иконы Троицы и в краеведческих описаниях обители, составленных в XIX столетии. Единственное сведение об «образе местном Троицы Живоначальной», который был обложен серебром и украшен шитой пеленой Григорием Гнилевским, содержится во вкладных и кормовых книгах Борисоглебского монастыря, однако опубликовавший эти книги русский историк и краевед А.А. Титов не смог обнаружить такого образа среди нового убранства монастырских храмов. Более вероятно, что икона поступила в Борисоглебский или непосредственно в Ярославский музей из Троицкого погоста на Бору, где до 1764 года существовал женский Троицкий монастырь, приписанный к Борисоглебскому и бывший в XVI веке местом пострижения знатных женщин из опальных семей. Монастырская опись, составленная в 1762–1763 годах, накануне секуляризации, упоминает четыре иконы Троицы, однако приведенных сведений недостаточно для уверенного отождествления ни одной из упоминаемых икон с публикуемым памятником, так что вопрос о первоначальном происхождении «Троицы» пока остается открытым.

Существует предположение, что икона Троицы была вложена в Борисоглебскую или Троицкую обитель Иваном Грозным, в пользу чего может свидетельствовать исключительно высокое художественное качество иконы и близость ее живописных приемов московской школе грозненского времени, с ее плотными, насыщенными цветами и изысканным, классически правильным рисунком, выдающим знакомство с византийскими образцами позднепалеологовского времени. Среди ближайших аналогий публикуемой иконы можно назвать образы Богоматери, архангелов Михаила и Гавриила и мучеников Георгия и Димитрия из деисусного чина иконостаса Спасо-Преображенского собора в Ярославле, исполненного, по-видимому, той же смешанной артелью московских и ярославских мастеров, которая расписывала собор в 1563 году.