В среднике иконы святые Борис и Глеб представлены в рост, в княжеских одеждах и с традиционными атрибутами воинов-мучеников. В правой руке каждый из них держит крест, символ исповедания христианской веры и принятия мученической смерти, а в левой – опущенный меч. Древнейшим протографом таких изображений святых князей, получивших широкое распространение в древнерусском искусстве, могла послужить не дошедшая до нас икона XI века из Борисоглебского храма-реликвария в Вышгороде, близ Киева.

Святые стоят не строго фронтально, как в большинстве подобных композиций, а в легком повороте друг к другу, словно беседуя. Ясность и просветленность внутреннего мира, тонкость индивидуальных характеристик определяют почти портретные образы князей. Близкой литературной параллелью состоянию души персонажей является одна из цитат из Священного Писания, которая использована в древнейшем «Сказании о Борисе и Глебе»: «В любви нет страха, но совершенная любовь изгоняет страх, потому что в страхе есть мучение» (1 Ин. 4: 18). Подобный тип образа можно рассматривать как один из отличительных признаков московской школы иконописи рубежа XIV–XV столетий – наряду с особенностями плавного, ритмически согласованного рисунка и неяркого колорита. Первоначальные цвета поновленных в XVI веке одежд святых князей не отличались контрастностью, как сейчас: их далматики имели серо-голубоватый тон, плащ на Борисе был коричневым, со светло-желтой подкладкой, а на Глебе – светло-охряным, с коричневатой подкладкой.

Икона из Коломны – самая ранняя из дошедших до нас житийных икон святых князей. Древнейшее Житие Бориса и Глеба, повествующее об их убийстве в 1015 году братом Святополком, было составлено во второй половине XI века.

Икона была храмовым образом церкви Бориса и Глеба в Коломне. Это происхождение дополнительно подтверждает создание произведения московским мастером.