После шестилетних мучительных поисков темы для картины, подводящей итог пенсионерского пребывания в Италии, своего рода отчета перед Императорской Академией художеств, после полосы отчаяния и разочарования в призвании художника, после блужданий между авторитетами Брюллова и Иванова, Ге обретает собственную тему и собственный голос. Читая Евангелие и сочинение Д.Ф. Штрауса «Жизнь Иисуса», он увидел в сюжете Тайной вечери «присутствие драмы». «Вот, понял я, чтó мне дороже моей жизни, вот тот, в слове которого не я, а все народы потонут. <…> Чрез неделю была подмалевана картина, в настоящую величину, без эскиза». Избрав сюжет, многократно трактовавшийся в мировом искусстве, Ге предложил новое и смелое для своего времени прочтение. Событие Евангелия было осмыслено в нравственно-психологическом плане. Новация Ге заключалась в очеловечивании божественного образа и его психологизации. В «Тайной вечере» (1863, Государственный Русский музей) поражало и вызывало споры то, что автор наделил евангельских персонажей человеческими эмоциями: Христос глубоко огорчен, апостолы пребывают во власти гнева и удивления.

Ге порывал с иконографической традицией, с каноном. Работая над картиной, он обратился к первоисточнику, к тексту Евангелия, к своему личному чувству и к реконструкциям Э. Ренана и Д.Ф. Штрауса, известных библеистов ХIХ века. Ренан так описывал обстановку пасхальной трапезы Христа и двенадцати его учеников: «Вечером он в последний раз ужинал со своими учениками. <…> Иоанн возлежал на диване рядом с Иисусом… В конце ужина тайна, тяготившая душу Иисуса, чуть у него не вырвалась. "Истинно говорю вам, – сказал он, – один из вас предаст меня". Эти наивные люди почувствовали в тот момент смертельную тоску; они переглядывались, и каждый внутренне задавал себе вопрос. <…> [Иисус] обмакнул кусок хлеба и подал его Иуде. Одни Иоанн и Петр поняли в чем дело. Иисус обратился к Иуде со словами, в которых заключался кровавый упрек, непонятный для остальных присутствующих. … После этого Иуда вышел».

Облику Христа приданы черты А.И. Герцена (этюдом послужила фотография С.Л. Левицкого), в образе негодующего апостола Петра Ге изобразил себя.

«Тайная вечеря» Ге поражала современников и совершенно новым толкованием личности Иуды. В его измене художник увидел не проявление низости натуры, а протест против учения Христа. Ге считал, что во время Тайной вечери произошел раскол среди единомышленников. Христос знает, кто предатель, но не останавливает его, он дает событиям идти своим чередом. Расстановка акцентов внутри самой сцены, выделение образа Иуды были совершенно апокрифичны. В отличие от традиционной трактовки евангельского события, когда названный Христом будущий отступник остается неузнанным, Иуда в картине Ге уходит опознанным, на него устремлены потрясенные, негодующие взоры апостолов Иоанна и Петра. Это приводит к драматически заостренной ситуации. Обнаженность конфликта, трактовка его как идейного раскола, принципиального разногласия сторонников двух различных мировоззрений и составляет наиболее оригинальную черту произведения.

В создании эмоциональной атмосферы полотна драматургия света и тени несет символическую смысловую нагрузку. Иуда весь – огромная, странная и страшная тень. Его фигура изображена контражуром: он буквально встал против света, заслонив собой его источник, Христа. Мрачный, таинственный, черный силуэт Иуды на фоне стены, отблески огня на лицах Христа и апостолов словно предвещают скорую драматическую развязку; огромные тени, движущиеся по стенам, нагнетают атмосферу общей тревожности.

Картина принесла Ге первый настоящий успех у публики, критики и академических профессоров. В 1863 году Императорская Академия художеств удостоила Ге звания профессора, минуя звание академика. «Тайная вечеря» была куплена для музея Академии. Для русской публики она стала открытием новой самостоятельной творческой индивидуальности.

П.М. Третьяков впоследствии выражал сожаление, что картина оказалась не в его коллекции, но в 1925 году ее уменьшенное повторение, исполненное Николаем Николаевичем Ге по заказу московского купца К.Т. Солдатенкова пополнило собрание Галереи.